Новая тест-система поможет точно выявлять возбудителя бруцеллеза в продуктах животноводства и в крови животных

Ученые ИОХ РАН впервые синтезировали олигосахариды, имитирующие фрагменты ключевого компонента клеточной стенки Brucella – макроциклического β-(1→2)-связанного D-глюкана «полисахарида В». Бруцеллы— бактерии, вызывающих бруцеллез. Это заболевание поражает домашний скот и может передаваться человеку, приводя к повреждению многих органов и тканей — от костей до головного мозга. Используя новые соединения и их конъюгаты с белком, авторы получили антитела, способные обнаруживать полисахарид В и содержащего его возбудителя заболевания в биологических образцах. Используемые на сегодняшний день методы диагностики бруцеллеза имеют низкую точность, поэтому разработка нового метода позволит вовремя предупреждать вспышки этого заболевания. 

Бруцеллез — опасное инфекционное заболевание, вызываемое бактериями из рода Brucella, — поражает домашний скот, в частности коров, коз, свиней и овец. Человек также может заразиться бруцеллезом при контакте с больным животным или при употреблении зараженных продуктов питания, например молока и сыра. При этом у людей заболевание проходит тяжело: если пациенту своевременно не назначают антибиотики, бактерии могут поразить практически все органы и ткани, включая опорно-двигательный аппарат, нервную, дыхательную и кровеносную системы. В России ситуация с бруцеллезом остается нестабильной: периодически в разных регионах фиксируют вспышки заболеваемости у домашних животных, при этом проблема особенно актуальна для Северо-Кавказского и Южного федеральных округов. 

Из-за вспышек бруцеллеза приходится забивать целые стада, что приводит к экономическим потерям, а при неточной диагностике (ложноположительных тестах на инфекцию) — к уничтожению здоровых животных. Существующие тесты часто дают ложноположительные результаты из-за того, что они нацелены на выявление в крови антител к так называемому О-полисахариду — компоненту клеточной стенки бактерий. Действительно, если Бруцелла попадает в организм животного или человека, иммунная система распознает ее О-полисахарид и вырабатывает специфичные антитела, но их присутствие в крови вовсе не является подтверждением действующей инфекции. 

Более того, О-полисахариды с похожей структурой есть и у других бактерий, например, у кишечной палочки (Escherichia coli). В результате тест-системы часто «путают» О-антигены разных микроорганизмов. Из-за этого используемые на практике подходы не позволяют отличить вакцинированных животных от зараженных, а также выявить инфекцию в продуктах питания. Поэтому новые методы диагностики критически важны и актуальны.

Ученые из Института органической химии имени Н.Д. Зелинского РАН , Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ и медиками Российского университета дружбы народов  предложили использовать для диагностики бруцеллеза другой компонент клеточной стенки Бруцелл — циклический β-D-глюкан, или полисахарид B. Это соединение, состоящее из 17–25 связанных в кольцо мономеров глюкозы, в больших количествах вырабатывается Бруцеллами, а потому может служить хорошим маркером их присутствия в организме. Однако к полисахариду В не вырабатываются специфические антитела, поэтому тест-систем для его выявления до сих пор не было.

Авторы решили эту проблему, синтезировав серию олигосахаридов, по структуре повторяющих фрагменты природного полисахарида В. Соединения различались количеством мономеров — их было от двух до пяти. При этом исследователи столкнулись с тем, что при добавлении каждого нового фрагмента эффективность синтеза резко снижалась. Однако оптимизация условий реакции, включая подбор растворителя, позволила получить требуемые соединения с высоким выходом.

Авторы сравнили 3D-структуры полученных веществ с природным полисахаридом В и выяснили, что наиболее близким к естественной молекуле оказался олигосахарид, содержащий пять мономеров. Его авторы соединили с белком бычьим сывороточным альбумином. Это было нужно для того, чтобы придать соединению иммуногенные свойства, то есть способность вызывать иммунный ответ. Так, сами по себе олигосахариды, как и природный полисахарид В не приводят к выработке антител в организме животных, но в комплексе с белком такая способность у них появляется.

Полученный иммуноген на основе олигосахарида и белка ученые дважды с интервалом в 14 дней вводили кроликам. Спустя 28 дней после первого введения у животных выработались антитела, специфичные к использованному для иммунизации олигосахариду. Кроме того, эти антитела оказались специфичны и к природному полисахариду В, благодаря чему их можно будет использовать для точного выявления бактерий в крови животных и человека, а также в продуктах питания.

«Природный полисахарид В практически не вызывает выработку специфичных к нему антител, поэтому ранее он не рассматривался в качестве диагностического маркера при выявлении бруцеллеза. Однако мы создали искусственные молекулы, частично имитирующие его структуру и вызывающие иммунный ответ. Именно благодаря этому удалось получить специфические антитела, которые могут лечь в основу высокоточных тест-систем для диагностики заболевания и проверки мясомолочной продукции. Для внедрения результатов в практику мы ведем переговоры с профильными ведомствами и надеемся на их внимание и поддержку. Ведь бруцеллез остается самой распространенной зоонозной инфекцией в мире, самой неохваченной вниманием и самой игнорируемой на сегодняшний день, а те меры, которые сегодня применяются, даже не являются эффективно сдерживающими», — рассказывает руководитель проекта, поддержанного РНФ, член-корреспондент РАН Николай Нифантьев, заведующий лабораторией химии гликоконъюгатов Института органической химии имени Н.Д. Зелинского РАН.

Результаты исследования, поддержанного грантом Российского научного фонда для лабораторий мирового уровня, опубликованы в журнале Communications Chemistry, входящем в группу журналов Nature.

Источник: РНФ.