Лаборатория химии гликоконъюгатов (№52)

Все исследования проводятся совместно с  Лабораторией синтетических гликовакцин (№41).

Обе лаборатории проводят исследования по структурному, спектральному (ЯМР), конформационному анализу и моделированию, а также изучению биологической активности природных и синтетических олиго- и полисахаридов. Разрабатываются новые методы химии углеводов, в особенности методы стереонаправленного построения 1,2-цис- и 1,2-транс-гликозидных связей, региоизбирательной постановки и удаления О- и N-защитных групп, получения аминосахаров путём азидофенилселенилирования гликалей, фуранозидных производных путём пиранозид-фуранозидной перегруппировки, высокосульфатированных олигосахаридов путём кислотнопромотированного сульфатирования, а также разнообразных других производных. Важнейшие направления работ связаны с получением функционализированных конъюгатов синтетических олигосахаридов, а также диагностических тестов и углеводных вакцин 3-его поколения для обнаружения и профилактики развития опасных бактериальных и грибковых инфекций. Ряд синтезированных соединений исследуются в качестве потенциальных лекарств для кардиологии, онкологии и гематологии.

2021

✓  Изучены структура и биологическая активность сульфатированных полисахаридов из морских иглокожих и рыб

Проведено структурное и биохимическое исследование сульфатированных полисахаридов из морских животных. Так, из морской звезды Lysastrosoma anthosticta были выделены полисахариды дерматансульфат и гепариноид, содержащие необычный моносахаридный фрагмент — 2,3-ди-О-сульфатированную α-L-идуроновую кислоту. Оба полисахарида проявляли высокую антикоагулянтную активность. Аналогично, из морского огурца Holothuria hilla был выделен необычный высокоразветвленный фукозилированный хондроитинсульфат, содержащий фукозные заместители не только при О-3 остатка глюкуроновой кислоты, но и при О-6 остатка N-ацетил-галактозамина. Этот полисахарид является активным антикоагулянтом. Также найдено, что хондроитинсульфат из хряща рыбы Salmo salar и фукозилированный хондроитинсульфат из морского огурца Apostichopus japonicus являются не только антикоагулянтами, но и стимуляторами гемопоэза. Показано, что оба полисахарида эффективно восстанавливают популяции основных типов клеток крови у мышей после иммуносупрессии, вызванной циклофосфаном. Примечательно, что в аналогичных условиях рекомбинантный колониестимулирующий фактор (r G-CSF) восстанавливал только популяцию лейкоцитов. Полученные данные создают основу для разработки востребованных терапевтических стимуляторов гемопоэза нового типа.

✓  Впервые синтезированы олигосахариды, родственные узлу разветвления недавно открытого  галактоксиломаннана (GalXylMan) — полисахаридного антигена патогенных грибов Cryptococcus neoformans

Поверхность клетки патогенных грибов Cryptococcus neoformans покрыта капсулой, состоящей из сложной композиции полисахаридов. Этот патогенный гриб является возбудителем криптококкового менингита (криптококкоза) — тяжёлого инфекционного заболевания, поражающего головной мозг человека, особенно людей с ослабленным иммунитетом — онкобольных, пациентов с ВИЧ и др., но в 5–15% случаев криптококкоз развивается и у условно здоровых пациентов. Взаимодействие полисахаридов C. neoformans с рецепторами на клетках человека приводит к активации иммунитета для нейтрализации патогена. Для выяснения механизма данного процесса и установления фрагментов полисахаридов, распознавание которых может вызвать защитную реакцию иммунной системы, нами проводится систематический синтез соответствующих олигосахаридов и изучение их иммунологических свойств. Так, впервые синтезированы олигосахариды, родственные узлу разветвления недавно открытого галактоксиломаннана (GalXylMan) C. neoformans. С использованием полученных соединений был проведен структурный анализ полисахарида GalXylMan, а также исследование конформационной подвижности узла разветвления и галактофуранозных звеньев в GalXylMan. Полученные данные создали основу для моделирования взаимодействия полисахарида с белковыми рецепторами, а также разработки вакцин и новых диагностических тест-систем для обнаружения инфекции C. neoformans.

✓  Установлена структура первых представителей нового семейства антибиотиков — Гауземицинов А и В

Установлена структура первых представителей семейства нового класса природных антибиотиков, гауземицинов А и В, продуцируемых Streptomyces sp. штамма INA-Ac-5812. Антибиотики относятся к липогликопептидам, имеют циклический скелет и содержат редкие структурные элементы, особенно α-L-арабинопиранозный остаток, петидный кор и др. Показана выраженная Ca²⁺-зависимая активность гауземицинов А и В в отношении грамположительных бактерий, что создало перспективу для получения эффективных противобактериальных средств на основе полученных соединений после оптимизации их структур и профиля фармакологических характеристик.

Angew. Chem. Int. Ed., 60 (2021) 18694-18703

✓  Изучены 2-азидофенилселенилирование и 2-фенилселеноацетилирование гликалей

Разработаны препаративные условия для одностадийного 2-азидофенилселенилирования и 2-фенилселеноацетилирования гликалей. В первом случае реакция проводится при взаимодействии гликалей с Ph₂Se₂, PhI(OAc)₂ и NaN₃ при интенсивном перемешивании. Так, из 3,4,6-три-O-ацетил-D-галакталя с высоким выходом 58% образуется кристаллический фенил-3,4,6-три-O-ацетил-2-азидо-2-дезокси-1-селено-α-D-галактопиранозид — малодоступный другими методами, но очень эффективный блок для сборки сложных олигосахаридов. Найдено, что при проведении реакции без перемешивания образуются соответствующие 1-O-ацетил-2-селено-2-дезоксипроизводные — продукты ацетоксифенилселенилирования гликалей под действием PhI(OAc)₂ и Ph₂Se₂. Указанные продукты являются удобными промежуточными соединениями для получения 2-дезоксисахаров. Проведено детальное исследование синтезированных 2-селено-2-дезоксигликозидов методами спектроскопии ¹Н, ¹³С и ⁷⁷Se ЯМР, в том числе впервые определены закономерности величин химических сдвигов и КССВ ⁿJ_Se-H, в зависимости от стереохимической конфигурации моносахаридного кольца и аномерного центра.

Eur. J. Org. Chem. (2021) 5897-5904

✓  Изучена конформационная подвижность фуранозидных циклов

Для выяснения особенностей 3D-строения фуранозил-содержащих олигосахаридов, влияющих на их иммунологические свойства, проведены теоретические исследования конформационной подвижности галактофуранозильных остатков как в виде моносахаридов, так и в составе олигосахаридов. В работе сопоставлялись квантово-химические методы для анализа конформационного состояния, которые включали классический метод Хартри-Фока, метод функционала плотности (DFT) с различными функционалами (B3LYP, PBE0, а так же двойной гибридный функционал B2PLYP) и приближение RI-MP2. В случае функционала B3LYP использовалась так же дисперсионная коррекция Гримме D3. Кроме незамещённых фуранозидных производных исследованы и структуры, имеющие в своем составе остаток молочной кислоты при О-3. Найдено, что для адекватного описания конформационного равновесия необходимо использование как минимум метода DFT с дисперсионной поправкой. Методы RI-MP2 и B2PLYP так же демонстрировали удовлетворительные результаты, но при этом они являются существенно более требовательными к вычислительным ресурсам. Было показано, что в моносахаридах, модифицированных молочной кислотой, вращение данного остатка может вызывать конформационные переходы в фуранозидном кольце, чего обычно не наблюдается в пиранозидных структурах. Анализ оптимизированных структур методом Natural Bond Orbitals (NBO) позволил предположить, что этот эффект может быть связан с так называемым 1,3-син-диаксиальным расталкиванием неподеленных электронных пар на атомах кислорода О-3 и О-1. Так же был проведен квантово-механический расчет ЯМР констант экранирования ¹Н фуранозидных колец. Выяснилось, что, в отличие от пиранозидов, константы экранирования в фуранозидах слабо меняются в зависимости от конформации пиранозного цикла.

✓  Исследована эпитопная специфичность антитела EB-CA1 из коммерческого диагностикума Candida albicans

Используя панель иммобилизованных на поверхности иммунологического планшета манноолигосахаридов (Glycoarray), структурно родственных фрагментам полисахарида маннана грибкового патогена Candida albicans, установлена эпитопная специфичность моноклонального антитела EB-CA1, которое используется в иммуноферментном диагностикуме Platelia Candida Antigen Plus (Bio-Rad, Франция). Указанный диагностикум предназначен для обнаружения в образцах сыворотки крови маннана как маркера инвазивного кандидоза, являющегося особо опасным грибковым заболеванием с высоким уровнем летальности. Поражение Candida, например для госпитализированных с инфекцией COVID-19, может кратно увеличивать вероятность смертельного исхода. Именно поэтому необходимость контроля маннанового маркера внесена в рекомендации по лечению и диагностике инфекции COVID-19. Проведённое исследование показало, что производителем набора Platelia Candida Antigen Plus неправильно установлена специфичность антитела EB-CA1, которое распознаёт трисахаридный эпитоп b-Man-(1®2)-a-Man-(1®2)-a-Man, а не гомо- a-(1®2)-связанный пентасахарид, как сообщается производителем. Это может снижать чувствительность и специфичность диагностикума на основе антитела EBCA-1. Полученные данные выявили пути для создания более эффективного антитела для обнаружения маркерного маннана.

2022

✓  Установлен механизм действия Неопетрозида А – активного компонента для создания антиинфарктного лекарства нового типа

В ходе химических и биохимических исследований in vitro и in vivo, а также компьютерного моделирования, установлен механизм действия Неопетрозида А. Микроколичества данного соединения были впервые охарактеризованы авторами среди экстрактивов из морской губки Neopetrosia, а благодаря направленному синтезу сначала была установлена точная структура, а теперь установлены и многообещающие фармакологические характеристики, открывающие возможность использования в качестве активного компонента при создании кардиопротектора нового типа. При исследовании биологической активности данного соединения найдено, что:

• Неопетрозид А (NPS A) стабилизировал сердечную гемодинамику и дыхательную способность митохондрий ex vivo после ишемического/реперфузионного повреждения сердца крыс.
• NPS A значительно предотвращал развитие кардиофиброза in vivo у мышей, с синдромом ишемии/реперфузии миокарда.
• При действии NPS A in vivo и ex vivo сохраняются функции митохондрий.
• Киназный скрининг in vitro, in silico моделирование, включая докинг, а также анализ с помощью SPR показали, что NPS A напрямую взаимодействует с киназой GSK-3b.
• Ингибирование GSK-3b регулирует соотношение НАД/НАДФ путем независимой от фосфорилирования активации оси NRF2/NQO1.

Полученные результаты опубликованы в новом специализированном журнале JACC: Basic to Translational Science, издающимся известнейшей издательской группой в области кардиологии — Journal of the American College of Cardiology. Учитывая значимость проведённого исследования, ему посвящен подробный комментарий редакции (Editorial comment) «Sponging Away Cardiac Injury. A Natural Compound Shows Cardioprotective Promise» (Смягчение сердечно-сосудистых заболеваний. Природное соединение демонстрирует кардиозащитные свойства). Работа выполнена в сотрудничестве с ТИБОХ ДВО РАН и Inje University (Ю.Корея).

✓  Изучены структура и биологическая активность сульфатированных полисахаридов из трёх видов голотурий

Из голотурий выделены новые представители сульфатированных фукозосодержащих полисахаридов. Фукозилированные хондроитинсульфаты (ФХС) из всех трех видов имеют обычную структуру углеводной части и различаются только положением сульфатных групп. Частичная деполимеризация ФХС из C. japonica использована для подтверждения предложенной ранее интерпретации спектров ЯМР этих полисахаридов. Необычные фукансульфаты (ФС) найдены в двух других голотуриях: B. argus содержит редко встречающийся регулярный линейный ФС, тогда как в H. spinifera одновременно содержатся два ФС различной структуры.

✓  Разработан оптический наносенсор для анализа галактоманнана Aspergillus

Разработан оптический наносенсор для высокочувствительного и специфичного обнаружения галактоманнана — диагностического маркера опасного заболевания инвазивного аспергиллёза, вызываемого грибковым патогеном Aspergillus fumigatus. Метод позволяет обнаруживать галактоманнан в клинических изолятах при концентрациях менее 1 нг/мл, в том числе при автоматизированном проведении анализа. Основными компонентами диагностической тест-системы сэндвичевого типа являются синтетический олигосахарид, отражающий иммунодетерминантный фрагмент галактоманнана, моноклональное антитело, распознающее галактоманнан и полученное с использованием синтетического олигосахарида, а также наночастицы золота. Работа выполнена в сотрудничестве с ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт оптико-физических измерений» (ФА Росстандарт), ООО ХЕМА и ГК «КОРТЭК».

2023

✓  Установлена структура высокоафинного лиганда рецептора DC-SIGN

Рецептор DC-SIGN, экспонированный на дендритных и некоторых других иммунных клетках, играет важную роль в формировании защитной реакции иммунной системы человека. Долгое время имелась противоречивая информация о структуре углеводных лигандов данного рецептора, экспонированных на поверхности клеток патогенов, распознавание которых индуцирует формирование защитной реакции иммунной системы. В частности, сообщалось, что такими лигандами являются производные олигосахаридов 34 и 35 (см. рисунок ниже), а также, что наиболее активный лиганд входит в состав гетерогенного разветвленного полисахарида маннана, экспонированного на клеточной мембране Candida albicans и ряда других микопатогенов. С использованием панели специально синтезированных олигосахаридов, родственных основным типам грибковых полисахаридов, была выявлена группа высокоспецифичных лигандов DC-SIGN, включающих пентаманнозидный фрагмент, состоящий из последовательности маннозных звеньев, соединенных между собой α-(1→2)- и α (1→3)-связями. Проведенные конформационный анализ, теоретический экспериментальный докинг (ЯМР-STD) позволили установить топологию углевод-белкового распознавания и выявить структуру высокоафинного эпитопа, вовлечённого во взаимодействие с DC-SIGN. Он не является общим для всех видов грибов, что может объяснять видоспецифический характер распознавания патогенов через рецептор DC-SIGN. Найденные высокоаффинные лиганды DC-SIGN являются не только инструментами для исследований механизмов грибкового врожденного иммунитета и антикандидозной защиты, но и создали основу для дизайна иммуномодуляторов и компонентов вакцин, которые уже ведутся авторами работы. Работа выполнена в сотрудничестве с Университетами Бильбао (Испания) и Экстера (Великобритания).

✓  Экспериментальное и квантово-химическое исследование механизмов внутримолекулярного стереоконтроля в реакциях α-глюкозилирования

Методами квантовой механики проведено изучение серии предполагаемых интермедиатов, образующихся в реакции глюкозилирования с участием глюкозил-трифлатов и соответствующих им оксокарбениевых ионов (см. рис.). В качестве модельных соединений использованы сполна бензилированные моносахариды, различающиеся заместителями при О-6. Методом функционала плотности проведено сканирование торсионного угла, описывающего вращение вокруг связи С5-С6 в исследованных структурах. Найдено, что замена заместителя при О-6 с бензильного на бензоильный приводит к заметному изменению конформационного поведения данной связи: вместо гош-гош конформера, характерного для обычных производных глюкозы, становится заметен вклад транс-гош конформера, а в случае электроотрицательных фторсодержащих бензоильных заместителей данный конформер становится преобладающим. Обнаруженный эффект был объяснён исходя из предположения, что наличие при О-6 бензоильного заместителя, особенно электроотрицательного, приводит к ослаблению 1,3-син-диаксиального расталкивания неподеленных пар на атомах кислорода О-6 и О-4. Данный вывод был подтвержден результатами квантово-химических расчетов методом NBO. Дополнительным вероятным объяснением наблюдаемого конформационного эффекта, вызываемого заместителем при О-6, может являться и π-π взаимодействие фенильных колец в транс-гош конформерах (показано красной стрелкой), возможность которого подтверждена расчетами. Полученные результаты могут быть объяснением наблюдаемого экспериментально изменения α/β-селктивности в реакциях глюкозилирования. Найденные закономерности влияния заместителя при О-6 были успешно использованы нами для стереоспецифичного синтеза серии α-(1→3)-связанных олигоглюкозидов, структурно родственных фрагментам α-(1→3)-D-глюкана патогенного грибка Aspergillus fumigatus.

✓  Cинтез олигосахаридов, отвечающих фрагментам поверхностных полисахаридов Klebsiella pneumoniae O3 и исследование их иммунохимические свойства

Впервые проведен стереонаправленный синтез олигосахаридов, отвечающих терминальным фрагментам O-цепи липополисахарида (ЛПС) патогенной бактерии Klebsiella pneumoniae серотипа O3, а также их биотинилированных конъюгатов. В сотрудничестве с коллегами из НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (Москва), ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России (Ростов-на-Дону), ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА (С.-Петербург) с использованием специально разработанного метода для анализа антигенных свойств олигосахаридов, установлены иммунодетерминантные фрагменты О3-антигена, что создало основу для последующей разработки вакцины против госпитальных инфекций, вызываемых антибиотикорезистентными штаммами Klebsiella pneumoniae О3, — опаснейшего заболевания, характеризующегося тяжелым течением и высокой летальностью.

✓  Исследован уровень ASCA антител (маркер воспалительных заболеваний кишечника) в сыворотках крови пациентов с колоректальным раком и здоровых доноров

Впервые проведено систематическое исследование уровня антител к олигосахаридам, родственным известному маркеру воспалительных заболеваний кишечника (ASCA-антигену), в сыворотках крови пациентов с колоректальным раком и здоровых доноров. С использованием специально разработанных методик формирования углеводного дисплея определены структурные модификации в цепях α‑маннана, существенно изменяющие их антигенные свойства, а также выявлены перспективные олигосахаридные лиганды, демонстрирующие различные результаты для двух исследованных групп. Полученные результаты открывают новые возможности для совершенствования существующих тест-систем ИФА, а также для разработки диагностических наборов на основе фрагментов грибковых маннанов с новыми свойствами. В сотрудничестве с ФГБУ «НМИЦ онкологии» им. Н. Н. Блохина Минздрава России (Москва).

✓  Установлен механизм действия Неопетрозида B – активного компонента для создания антиинфарктного лекарства нового типа, обладающего противораковой активностью

Проведены биохимические исследования in vitro и in vivo, а также компьютерного моделирования, установлен механизм биологической активности Неопетрозида В. Микроколичества данного соединения были впервые охарактеризованы авторами среди экстрактивов из морской губки Neopetrosia, а благодаря направленному синтезу сначала была установлена точная структура, а теперь установлены и многообещающие фармакологические характеристики, открывающие возможность использования в качестве активного компонента при создании кардиопротектора нового типа, обладающего противораковым эффектом на уровне доксорубицина, но проявляющегося по иному механизму. Полученные результаты опубликованы в специализированном журнале Biomedicine & Pharmacotherapy. Работа выполнена в сотрудничестве с ТИБОХ ДВО РАН и Inje University (Ю.Корея).